多重熒光探針PCR檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：禽流感病毒 H7N9 (AIV-H7N9)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name ：Avian Influenza virus subtype H7N9 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預期用途】

禽流感是由 A 型流感病毒所引起的禽類疾病。AIV 除了感染禽類外，部分亞型也

能夠引起人感染或發(fā)病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般對其不致病，當它

們傳染給其它物種時有時會造成大的發(fā)病率和死亡率。2013 年我國*報道了人感

染 H7N9 型 AIV，至 2015 年有 571 例感染，212 人死亡。H7N9 AIV 對禽類表現(xiàn)低

致病性，它引起家禽很輕微的或不引起臨床癥狀，但對人卻表現(xiàn)很高的致病性[1]。

本試劑盒適用于檢測標本中的禽流感病毒 H7N9，適用于禽流感病毒 H7N9 感染

的輔助診斷及流行病學調(diào)查。

【檢驗原理】

本試劑盒分別對禽流感病毒 H7N9 亞型的 HA 和 NA 基因設(shè)計特異性的引物和探

針[2-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對禽流感病毒 H7N9 RNA 進行體外擴增檢測，用

于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μL×1 管

AIV-H7N9 反應液 1.0mL×1 管

AIV-H7N9 陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 7 次，有效期 9 個月。

【適用儀器】

ABI 系列 、安 捷倫 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取

呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本

運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨

器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，

8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100

μL 提取。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提

取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對

照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑 AIV-H7N9 反應液 酶液

用量 20μL 1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反

應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道

（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI

系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)

整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)

節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動

閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

FAM 通道為禽流感病毒 H7N9 亞型 H7 基因檢測結(jié)果，CY5 通道為禽流感病毒

H7N9 亞型 N9 基因檢測結(jié)果

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試

驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。

6. 檢測方法的局限性

Ø 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

Ø 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定

量檢測不準確的結(jié)果；

Ø 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

【注意事項】

Ø 所有操作嚴格按照說明書進行；

Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

Ø 反應液應避光保存；

Ø 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

Ø 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通

則》進行處理。

【參考文獻】

[1] Morens D M, Taubenberger J K, Fauci A S. H7N9 avian influenza A virus and the perpetual challenge of potential human pandemicity [J]. MBio，2013, 4(4): e00445-13. [2] 羅思思, 謝芝勛, 劉加波, 等. H7N9 亞型 AIV 雙重實時熒光定量 RT-PCR 檢測方

法的建立[J]. 動物醫(yī)學進展, 2013, 34(12):1-5. [3] 徐曉龍, 包紅梅, 馬 勇, 等. H7 和 N9 亞型及 A 型流感病毒多重熒光 RT-PCR 檢

測方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報, 2014, 12, 36: 939-942.

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